IF5.6分,哈尔滨医科大学团队生信文章：代谢相关基因预测指标预测预后卵巢癌的免疫治疗反应和候选药物

 

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纯生信不好发了？那是你不够卷了。今天喵学姐就带大家看看这篇1月份的生信文章，通过代谢相关基因，用常规分析套路构建预后模型，就发到了一区5分+（共一还是本科生）

”

 

参考文献

 

 

 

 

 

研究背景

   

  卵巢癌(Ovarian cancer, OC)是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因之一，其占女性癌症的4%。由于早期诊断很困难，所以大多数人在晚年才被诊断出来。尽管 OC 的放疗、化疗、手术和靶向治疗取得了进展，5年生存率仍在45% 左右，其中3年主要是由于复发和化疗耐药。OC 患者的预后与肿瘤分期密切相关，肿瘤分期是公认的预后指标。然而，它们对预测 OC 患者的生存率和治疗反应无效。因此，有必要研究临床适用的指标，以提高临床结局预测和指导治疗决策。

 癌症中的异常代谢逐渐被发现被认为是一种潜在的治疗方法。代谢重编程被认为是癌症的新标志并在过去十年中得到了广泛的研究。这是一种肿瘤细胞快速生长的现象改变它们的能量代谢来适应酸性物质、营养贫乏和低氧的微环境。过去十年来，几种基于免疫的疗法已经获得了成功监管机构批准了几种实体瘤和血液恶性肿瘤。其中，国际投资银行已作出在妇科癌症方面的突出进展，证明抗肿瘤效果好。然而，免疫疗法是有益的只有一小部分OC患者，14例有代谢重编程是抗药性最常见的原因药物和治疗失败。因此，有必要研究微细胞异常代谢重编程肿瘤环境发展生物标志物预测对不同类型免疫疗法的反应。

 

 

 

 

思路亮点

 

1.该研究结合多个数据集验证MRGRI的预测效能和治疗结果，数据集包括黑色素瘤和OC相关的GEO数据集。

2.该研究的免疫分析部分丰富多样，其不仅进行了常规的免疫细胞浸润分析，还进一步探究了MRGRI与TIDE和T-cell排斥评分的关系。

3.该研究的免疫治疗部分在不进行实验验证的情况下，其结果全面且深刻。该部分不仅进行了药物筛选及分子对接，还通过巧妙的涉及考虑了药物治疗的延迟问题。

 

 

 

研究解读

思路图：

△图1，研究设计的流程图

 

 

方法部分

 

 

1.数据获取

该研究分别通过KEGG、Reactome、BRENDA和Human-GEM获取3936个代谢相关基因(Metabolism-related genes, MRGs)。其次，从TCGA数据库中获取了363名OC患者相关数据，包括RNA-seq、突变数据、生存数据和临床数据。最终，利用GEO数据库的数据集(GSE26712和GSE9891)作为验证集。

2.鉴定共表达代谢模块中与肿瘤分期相关的模块

为了获得代谢相关的共表达基因，该研究对3936个MRGs进行了WGCNA分析。WGCNA是一个能利用系统生物学方法表征样本中基因之间关系的模式。其可利用Hub genes或signature genes确认密切相关的基因簇，也可以用于连接具有外部属性的基因簇样本。

该研究利用WGCNA筛选出MRGs中关键的基因，最终获得了12个模块。其次，该研究探索了12个模块基因与临床特征的关系，最终选择了与肿瘤分期相关的模块。

3.Metabolism Related Gene Prognostic Index(MRGRI)的构建及验证

该研究首先使用单因素COX回归分析筛选出MRGs中与OC患者预后相关的基因。进一步，利用逐步COX回归分析筛选可独立预测OC患者预后的MTGs的基因。其次，利用逐步COX回归分析的结果构建预后模型(MRGRI)。然后，利用MRGRI中位数将OC患者分为两组。其次，我们分别使用Kaplan-Meier(K-M)生存分析和ROC分析评估模型的预后和诊断价值。最后，该研究利用验证集(GSE26712和GSE9891)验证了MRGRI模型在临床和预后的价值。

4.MRGPI亚组的基因组变异

该研究通过R包maftools绘制的瀑布图研究了高和低MRGRI亚组的体细胞突变的差异。其次，统计了同义突变和非同义突变的数目，并利用Wilcoxon检验它们的差异。

5.MRGPI亚组的分子特性和免疫现象

为了确定与MRGRI相关的潜在通路，该研究通过50种癌症标志并使用GSVA包获得MRGPI亚组中每个个体患者的数据。为了减少路径重叠和路径冗余，每个集合与一条通路相关的基因被修剪成独特的基因，以及任何与两种或两种以上途径相关的基因删除。大多数的基因组都保留了70%以上相关基因。为了寻找亚组间不同的途径，该研究使用了limma包分析GSVA结果。

该研究收集了113种免疫调节剂(如MHC、受体、趋化因子和免疫刺激剂)、细胞基因集、采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)对24个免疫和7个肿瘤免疫周期基因集进行免疫细胞浸润水平和肿瘤免疫周期活性评估。并利用了Pearson相关分析探索了MRGRI与免疫细胞及免疫调节的关系。此外，我们使用了Wilcoxon检验比较了不同MRGPI亚组之间的免疫细胞和癌症免疫周期的差异。

6.预测MRGPI亚组的免疫治疗反应

该研究采用了TIDE方法评估个体对免疫的反应概率，并采用Wilcoxon检验比较不同MRGPI亚组之间TIDE相关评分的差异。其次，利用SubMap算法预测MRGPI亚组对抗PD-1或anti-CTLA-4治疗的反应概率。该研究一个转移性黑色素瘤患者接受anti-PD-1治疗的数据集(GSE78220)用于检验MRGPI模型的预测能力。

7.高MRGPI患者的候选药物的评估

该研究从两个药物基因组学数据库获得了药物敏感性数据，这两个数据库分别为PRISM和CTRP。然后，该研究利用岭回归计算药物反应的AUC值，评价该研究中临床患者对候选药物的反应。其次，利用Pearson相关性评估AUC值与MRGPI的关系。负面关联的药物是对高MRGPI是有益的。此外，为了评估预测的准确性，该研究基于CCLE项目30个训练集表达谱和药物反应数据进行10倍交叉验证。

进一步，分析确定的相互作用药物和代谢相关蛋白，该研究通过PubChem数据库获得了四种药物的结构(ABT-737、crizotinib、panobinostat和 regorafenib)。该研究通过PDB数据库获得了MRGs中PC、AAK1、PTPN2和WARS的蛋白结构(分别为3BG3、4WSQ、1L8K和5UJI)，其次利用LibDock进行分子对接。

 

 

 

 

结果部分

 

 

 

Step1：获取关键MRG与肿瘤分期的交集基因

 

图2，鉴定与肿瘤分期相关的共表达代谢基因模块

WGCNA结果表明无标度网络的最优软阈值强度为5，相关系数大于0.90(图2A-B)。共11个模块(图2C)基于平均链接聚类层次和最优软阈值功率。该研究检查了模块与五个临床参数(年龄、分期、分级、淋巴浸润和尺寸)之间的关系。结果显示，5个模块与肿瘤分期密切相关(图2D)。

研究表明5个模块中有763个与肿瘤分期相关的MRGs。图2E表现了这些基因的共表达网络及强大的模内关联，并且阐述了基因在五个模块中的功能。

此外，该研究根据肿瘤分期(StageⅠ/Ⅱ和StageⅢ/Ⅳ)将表达谱分成两组，并获得了4293个与肿瘤分期相关的差异表达基因。图2F表明关键MRG与肿瘤分期有636个交集基因。交集基因的富集分析表明，这些基因不仅参与了代谢还参与了免疫系统、信号转导和其他重要的通路。

 

 

 

Step2：MRGPI模型的构建与鉴定

 

图3，模型的构建和验证。

作者首先利用单变量COX回归分析获得了27个与OC患者预后相关的关键MRGs。其次，采用逐步COX回归分析筛选得到了9个可独立预测OC患者预后的生物标记物(PC, UST,

PTPN2, RPL12, PLA2G2D, AAK1, WARS, SSH1和SIRT5)(图3A-D)。其中PC、UST、RPL12、

AAK1、SSH1是OC的危险因素;PTPN2、PLA2G2D、WARS和SIRT5是保护因子。图3E-F表明，低MRGPI患者的总生存率显著高于高MRGPI患者。图3D表明，该模型预测OC患者效果良好且稳定。图3H-J表明，高MRGPI与患者的DDS、PFI和DFI不良相关。

图4，MRGPI模型的验证

作者进一步利用GSE26712和GSE9891数据集验证9个关键MRGs与OC患者预后的关系(图4A)。图4B,E表明AAK1在3个数据集中是危险因子，而TPN2和WARS基因具有保护作用(图4C,D,F,G)。图4H,I,J表明MRGPI模型对OC患者预后具有较高的预测价值。

 

 

Step3：MRGPI亚组与免疫浸润水平的关系

 

图5，MRGPI亚群的分子和突变特征

作者为了探究不同分子间的特性MTGPI亚组，利用GSVA计算高和低MRGPI组癌症标志通路的富集分数(图5A)。MTGPI亚组组间突变的差异(图5B-C)。作者比较了突变的数目发现同义突变和非同义突变在低MTGPI人群中更普遍(图5D)。该研究表明，突变基因对的数量和类型与低MTGPI组相比高MTGPI组中同义突变和非同义突变有显著差异。

图6，MRGPI亚群的肿瘤免疫微环境

由于肿瘤免疫微环境可激活或者抑制抗肿瘤活性反应，因此作者比较了不同MRGPI亚群与免疫细胞的关系，包括免疫调节剂、免疫细胞和癌症免疫循环。免疫调节剂的分析表明，MRGPI主要与MHC分子的表达呈负相关，这表明该亚群中的抗原呈递和加工能力受到抑制。图6A表明，大多数适应性免疫细胞在低MRGPI组中更丰富。图6B表明，大多数免疫细胞类型与MRGPI呈负相关。图6C-H表明，MRGPI得分与淋巴细胞(aDC和DC)和树突状细胞(T 细胞、TReg细胞、Th1细胞和Th2细胞)呈负相关。

 

 

Step4：MRGPI亚群与免疫治疗的关系

 

图7,MRGPI亚组对免疫治疗的敏感性

图7A-C表明，低MRGPI亚组的免疫检查点表达较高，表明该人群可能更适合免疫治疗。其次，TIDE与MRGPI亚组的研究表明，低MRGPI亚组的TIDE得分更低(图7D)。TIDE得分越低意味着免疫逃逸可能性越小，表明患者免疫治疗的效果越好。图7E表明，低MRGPI亚组的T-cell排斥评分更低，这表明低MRGPI亚组对免疫治疗更敏感。最后，我们利用SubMap算法将本研究建立的MRGPI亚组的表达模式与另一个已发表的数据集(包括47名免疫治疗应答的黑色素瘤患者)进行对比。结果表明，低MRGPI组对PD1治疗更有前景(图7F)。

免疫治疗是通过间接作用的方法，其需要时间触发免疫反应并将其转化为免疫治疗效果。因此，延迟治疗在免疫治疗实验中经常出现。研究通过分配的方法研究MRGPI对免疫检查点治疗的预后价值和免疫治疗的延迟效应，我们将GSE78220队列的患者按四分位数划分为四个亚组(MRGPI高、最高、低和最低组)。我们比较了治疗后6个月和1年的限制平均生存时间差异。图7G表明，治疗后6个月的生存曲线无显著差异，而MRGPI最高组与MRGPI最低组在12个月生存时间存在差异。自免疫疗法存在延迟的临床效果，我们额外检查了12个月后的长期生存，发现MRGPI最低组的长期生存率明显高于MRGPI最高组(图7H)，这表明MRGPI得分越小的患者对免疫检查点抗性越小。

 

 

Step5：MRGPI药物敏感性分析

 

图8，高MRGPI患者潜在治疗药物的筛选

该研究分别使用CTRP和PRISM衍生的药物反应数据评估不同MRGPI组患者的药物敏感性。研究表明治疗OC的常用药物紫杉醇在MTGPI亚组间存在药物敏感性差异。该研究为了筛选高MRGPI亚组中高药物敏感性的潜在药物。首先，我们在CTRP和PRISM鉴定了113种交集的药物或化合物，以便于后期分析结果的交叉证实。然后，该研究进行差异药物反应分析，发现明显不同的药物，只保留那些高MRGPI组的AUC估计较低。剂量反应AUC值是药物敏感性的衡量标准，分数越低表明对治疗越敏感。此外，该研究还筛选了AUC值与MRGPI呈负相关的药物。最后，我们确定了四种具有高MRGPI治疗潜力的药物或化合物(包括ABT-737、crizotinib、panobinostat和regorafenib)(图8A-B)。

其次，该研究利用ADMETlab 2.0和SwissADME分析这些药物。结果表明，ABT-737化合物是最有希望的药物，其次是crizotinib和regorafenib。SwissADME分析结果与ADMETlab 2.0分析结果一致。为了进一步验证4种药物，该研究进行了四种代谢相关的分子对接，分别是蛋白PC、 AAK1、N2和WARS与候选药物。AAK1与WARS的对接模型ABT-737如图8D-E所示，其中对接得分别为136.956和187.838。为方便观察分子间的相互作用，该研究在2D图中显示了相互作用以及药物分子，ABT-737、AAK1和WARS蛋白在之间的距离(图8F,G)。这些候选药物有可能成为OC的治疗药物。

 

 

 

结论

 

作者通过一系列的分析，构建了一个在卵巢癌中与代谢相关的独立预测特征MRGPI，其与预测OC患者预后、免疫治疗反应和药物治疗密切相关。该论文为OC的预后预测和精准治疗指导提供了新的思路。